不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)都是為了滿足不同的實(shí)驗(yàn)需要，RNA轉(zhuǎn)染提供了另一種有別于DNA轉(zhuǎn)染的研究探索手段——直接將體外翻譯的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖體利用轉(zhuǎn)染技術(shù)帶入細(xì)胞中。由于不需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄即可直接翻譯，RNA轉(zhuǎn)染得到的結(jié)果比DNA轉(zhuǎn)染更快更直接，當(dāng)然**于瞬時(shí)表達(dá)。RNA轉(zhuǎn)染的這些特性很適合某些研究：比如處于非分裂期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者很難用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，RNA病毒的研究，反義RNA的轉(zhuǎn)染，sirna轉(zhuǎn)染(RNA干擾)等等。
哪些因素影響RNA轉(zhuǎn)染的效率?
既然都是核酸，傳統(tǒng)的DNA轉(zhuǎn)染方法都可以用來轉(zhuǎn)染RNA，不過頭疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。
RNA 操作要注意的事項(xiàng)我們就不用羅嗦了，轉(zhuǎn)染中要額外注意的就是轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該是確認(rèn)無RNase污染的，而且也盡量避免和質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染混用——即使試劑本身兼容DNA和RNA轉(zhuǎn)染，你也要想到人家做質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時(shí)往往不會(huì)這么小心，難免將污染混入，那你豈不是很冤?多數(shù)情況下轉(zhuǎn)染試劑都不建議自己分裝，因?yàn)椴煌墓懿目赡軙?huì)影響轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性，那就更得不償失了。所以RNA專用的轉(zhuǎn)染試劑會(huì)更好一些。還有重要的一點(diǎn)就是要采用上等無RNAse污染的血清。
轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞匯合度常常會(huì)比DNA轉(zhuǎn)染高一點(diǎn)，也許是因?yàn)镽NA轉(zhuǎn)染表達(dá)比DNA快?RNA轉(zhuǎn)染的用量必須參考轉(zhuǎn)染試劑說明，因?yàn)镽NA和轉(zhuǎn)染試劑的比例決定了轉(zhuǎn)染復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和凈電荷，以及是否容易被細(xì)胞膜吸附和內(nèi)吞。RNA少了固然表達(dá)不好，太多也會(huì)有毒性的問題。有的品牌轉(zhuǎn)染試劑有促核酸凝聚的試劑，幫助核酸折疊為較為致密的結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞沒有太大影響，轉(zhuǎn)染復(fù)合物和細(xì)胞共同孵育的時(shí)間越長當(dāng)然越好。不過，如果RNA本身帶有熒光標(biāo)記的化，檢測前通常要洗掉多余的RNA以免干擾結(jié)果。
除了操作，RNA本身的結(jié)構(gòu)也對(duì)轉(zhuǎn)染有一定的影響。哺乳動(dòng)物的mRNA分子帶有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端PolyA尾巴，此外還有成為 IRES(internal ribosomal entry site)的核糖體結(jié)合區(qū)，這些結(jié)構(gòu)或者有助于提高mRNA的穩(wěn)定性，或者有助于核糖體結(jié)合到mRNA上進(jìn)行翻譯。對(duì)于體外轉(zhuǎn)錄得到RNA可以通過實(shí)驗(yàn)加入模擬RNA5'端帽子結(jié)構(gòu)類似物而獲得這個(gè)保護(hù)性的“帽子”(Ambion公司有提供的)，3'端PolyA尾巴也可以通過實(shí)驗(yàn)添加。多數(shù)情況下添加這些元件有助于提高RNA進(jìn)入細(xì)胞后的穩(wěn)定性。但是有時(shí)候IRES元件促進(jìn)翻譯的進(jìn)行，而到有的細(xì)胞株中，由于缺乏相應(yīng)的結(jié)合蛋白，IRES反而影響轉(zhuǎn)錄。這個(gè)在RNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中是要格外注意的。RNA干擾實(shí)驗(yàn)中的sirna結(jié)構(gòu)對(duì)基因沉默效果也有影響，比如推薦添加的AA(N19)TT結(jié)構(gòu)(AA(N21)或者CA(N21)也是可以的)。這就不在轉(zhuǎn)染的討論范圍內(nèi)了。
Oligo轉(zhuǎn)染
反義寡核苷酸一度曾經(jīng)是制藥領(lǐng)域的希望之光。Oligo的轉(zhuǎn)染還是屬于DNA轉(zhuǎn)染，由于分子小，轉(zhuǎn)染的主要問題是轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定性。2'-O-methyl oligoribonucleotides比一般的Oligo穩(wěn)定，硫代S-Oligo可以抗拒核酸酶的降解但不可以磷酸化，如何選擇就要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩恕?/p>
我們終于結(jié)束了轉(zhuǎn)染這一部分。希望對(duì)你有所幫助。后我們再順帶介紹通常在轉(zhuǎn)染時(shí)遇到問題該如何面對(duì)——畢竟不同的細(xì)胞和不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模龅嚼щy往往是難于預(yù)料的，所以無論前人是否已經(jīng)為你提供了現(xiàn)成的方法，如果是除初次嘗試某種試劑或者某種細(xì)胞系，這幾個(gè)對(duì)照是一定要做的：空白對(duì)照，只加一定量核酸的對(duì)照，只加一定量轉(zhuǎn)染試劑的對(duì)照，2個(gè)以上不同的量比實(shí)驗(yàn)，對(duì)于檢查問題是非常有用的。
轉(zhuǎn)染效率低：可能的原因：
轉(zhuǎn)染試劑不適合(比如空白對(duì)照的細(xì)胞存活率就低等等)
轉(zhuǎn)染試劑和核酸或者蛋白的量不夠，或者比例不對(duì)(自行調(diào)整咯，別告訴我你不會(huì))
基因表達(dá)時(shí)間(檢測時(shí)間)有問題(孵育更長時(shí)間吧，如果沒有毒性問題的化，如果毒性也隨轉(zhuǎn)染效率提高，那就要縮小孵育時(shí)間拉)
副作用(比如目的基因的毒性)(換誘導(dǎo)型啟動(dòng)子吧)
核酸或者蛋白質(zhì)量問題(重做純化實(shí)驗(yàn))
報(bào)告基因或者檢測系統(tǒng)的問題
細(xì)胞死亡率高：
過量的轉(zhuǎn)染試劑或者轉(zhuǎn)染復(fù)合物(減少用量或者減少孵育時(shí)間，轉(zhuǎn)染后洗細(xì)胞)
細(xì)胞問題(重新復(fù)蘇活化一個(gè)細(xì)胞株，或者重新傳代)
目的基因毒性(減少用量)
轉(zhuǎn)染效率重復(fù)性差：
細(xì)胞匯合度不同(保證同樣的接種量同樣的時(shí)間)
支原體污染(殺了它吧，重新復(fù)蘇一管新的)
細(xì)胞傳代次數(shù)太高了(重新復(fù)蘇一管新的細(xì)胞)
血清質(zhì)量不穩(wěn)定(一次囤積同一批號(hào)的血清吧)
