電穿孔法轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞指南

Bio-Rad公司近日在其網(wǎng)站上發(fā)布了一篇技術(shù)指南，是由美國(guó)得克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心的Eva Zsigmond撰寫(xiě)的，講述的是如何利用Gene Pulser Mxcell電穿孔系統(tǒng)高效轉(zhuǎn)染小鼠和人的胚胎干細(xì)胞。

此技術(shù)指南(編號(hào)為5904)研究了電穿孔參數(shù)的優(yōu)化，以更高效地將DNA導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞，這些細(xì)胞是在克隆形成和無(wú)滋養(yǎng)層的條件下生長(zhǎng)的。

電穿孔是將基因?qū)胄∈笈咛ジ杉?xì)胞的理想方法。使用已經(jīng)確立的電穿孔參數(shù)，小鼠ES細(xì)胞能夠高效率地穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，在多能性和核型穩(wěn)定性方面沒(méi)有**影響。然而，與小鼠胚胎干細(xì)胞相比，人胚胎干細(xì)胞在電穿孔后存活率和轉(zhuǎn)染效率都要低一些。

目前關(guān)于電穿孔人胚胎干細(xì)胞的文獻(xiàn)不多，且大部分方法都是針對(duì)特定的細(xì)胞系或基因座，很難推廣到所有干細(xì)胞。于是，Zsigmond的研究小組想要優(yōu)化電穿孔參數(shù)，將DNA導(dǎo)入無(wú)滋養(yǎng)層條件下的ES細(xì)胞。

與其它系統(tǒng)相比，Bio-Rad的Gene Pulser Mxcell電穿孔系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)在于除了目前的程序，每個(gè)關(guān)鍵參數(shù)都是可編程的，從電壓到脈沖次數(shù)，讓研究人員能夠找到特定細(xì)胞的理想條件，包括難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞和干細(xì)胞。此外，該系統(tǒng)是96孔板形式，能篩選不同的電穿孔條件。

Gene Pulser Mxcell電穿孔系統(tǒng)采用開(kāi)放的架構(gòu)，允許Zsigmond的研究小組確定小鼠及人胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染的優(yōu)步驟，同時(shí)優(yōu)化細(xì)胞存活率。研究人員保持DNA 濃度恒定，細(xì)胞密度相近，采用不同的電壓(250 V和300 V)以及不同的電容參數(shù)(100 μF、200 μF、300 μF和950 μF)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和存活率。

研究表明，電容在200 μF時(shí)，細(xì)胞存活率和gfp表達(dá)都為有利的水平，而低電壓(250 V)時(shí)的存活率略高于高電壓。研究人員鑒定出人ES細(xì)胞的佳電穿孔條件為電壓250 V，電容 200 μF，電阻 1000 Ω及指數(shù)波形。不過(guò)這些結(jié)果還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

研究人員認(rèn)為電穿孔是將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的簡(jiǎn)單且有效的方法，且實(shí)驗(yàn)中針對(duì)無(wú)滋養(yǎng)層的ES細(xì)胞的電穿孔條件可能對(duì)未來(lái)的臨床應(yīng)用很重要。