GTP酶研究新工具（二）

小GTP酶中的Ras超家族作為分子開關(guān)，控制了多個真核細胞行為，包括細胞生長、分化和運動。因此，小GTP酶參與了一些**狀態(tài)，如癌癥和代謝**。與GTP結(jié)合時，GTP酶激活，而與GDP結(jié)合時，GTP酶失活。

為研究GTP酶的激活，賽默飛世爾科技公司推出了Pierce Active GTPase Pull-down and Detection Kit，可優(yōu)先富集活性形式的GTP酶。這些試劑盒包含了GST-蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，分別是活性Rho、Ras、Rac1、Cdc42、Rap1、 Arf1或Arf6選擇性的。

活性小GTP酶很難檢測，因為目前還沒有此種形式對應(yīng)的一抗。為了克服這個問題，pull-down方法利用了特定GTP酶的活性形式與已知下游效應(yīng)蛋白的親和力。下游效應(yīng)蛋白的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PBD)以GST融合蛋白的形式表達。當(dāng)固定在谷胱甘肽瓊脂糖樹脂上時，PBD將與細胞裂解液中活性GTP酶相結(jié)合。pull-down的活性GTP酶可通過Western Blotting檢測。

這種親和力提供了一種方法，從GTP酶的整體變化中區(qū)分瞬時上調(diào)或下調(diào)的活性GTP酶。這些瞬時的變化可能是因為細胞暴露在細胞因子或其他小分子刺激物或抑制劑中，也可能是因為細胞生長、分化、癌變和轉(zhuǎn)移中發(fā)生的變化。

作為對照，細胞裂解液可用GTPγS處理，這是一種GTP的非水解類似物。此方法能捕獲所有活性形式的GTP酶，實現(xiàn)GTP酶的大量富集。同時，細胞裂解液可用過量GDP處理，將大部分GTP酶轉(zhuǎn)變成非活性狀態(tài)，來作為陰性對照。

試劑盒經(jīng)過功能驗證，與小鼠、大鼠和人的多種細胞類型兼容，其中優(yōu)化的試劑、特異抗體和western blot的步驟確保了準(zhǔn)確的控制和半定量的結(jié)果。此外，您無需自己表達和純化GST-PBD融合蛋白，也無需使用昂貴的**沉淀親和樹脂。此試劑盒操作簡單，能在2小時內(nèi)完成。而微量離心柱能高效分離液體和樹脂，避免樣品損失和交叉污染。

該試劑盒包含了親和純化的試劑及對照，一個兼容的細胞裂解緩沖液，及終Western blot檢測的特異一抗，足夠開展30次pull-down。