Bio-Rad公司推出的EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒(EpiQ chromatin analysis kit )，利用常染色質(zhì)和異染色質(zhì)之間的差異來定量評估染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過原位染色質(zhì)消化、基因組DNA純化以及實時定量PCR，可以同時研究幾個基因啟動子的染色質(zhì)狀態(tài)。作為一款新穎的表觀遺傳學(xué)研究工具，EpiQ試劑盒可協(xié)助確定表觀遺傳學(xué)事件(如DNA甲基化和組蛋白修飾)對基因表達(dá)調(diào)控的影響。
EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒的原理和方法
常染色質(zhì)是轉(zhuǎn)錄活躍的部位，呈疏松的環(huán)狀，電鏡下表現(xiàn)為淺染，易被核酸酶在一些敏感的位點降解。與常染色質(zhì)相比，異染色質(zhì)是轉(zhuǎn)錄不活躍的部分，染色深，核酸酶無法接近，也就不能降解DNA。因此，利用核酸酶消化和QPCR，通過Cq改變就能評估染色質(zhì)狀態(tài)。
表觀遺傳學(xué)過程，如DNA甲基化和組蛋白修飾，通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來控制基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄活躍的基因與“開放”或“可接近”的染色質(zhì)區(qū)域相關(guān)，而轉(zhuǎn)錄沉默的基因通常與“關(guān)閉”或“難接近”的染色質(zhì)區(qū)域相關(guān)。
目前定量確定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的方法較為復(fù)雜，且耗時長。它需要從細(xì)胞中分離出細(xì)胞核，并進(jìn)行染色質(zhì)消化，通常需要兩天以上才能完成。Bio-Rad公司推出的EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒(EpiQ chromatin analysis kit )就是利用上面的原理來定量評估染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過原位染色質(zhì)消化、基因組DNA純化以及實時定量PCR，可以同時研究幾個基因啟動子的染色質(zhì)狀態(tài)。作為一款新穎的表觀遺傳學(xué)研究工具，EpiQ試劑盒可協(xié)助確定表觀遺傳學(xué)事件(如DNA甲基化和組蛋白修飾)對基因表達(dá)調(diào)控的影響。有了EpiQ試劑盒，無需分離細(xì)胞核，6小時即可獲得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)。此外，該試劑盒只需要較少量的細(xì)胞(低至50,000個)就能開展分析。
EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒的流程如下：在有或沒有核酸酶的情況下，利用染色質(zhì)緩沖液處理細(xì)胞1小時(37°C)。利用終止緩沖液來終止染色質(zhì)消化(37°C，10分鐘)，之后是基因組DNA純化和定量。通過實時定量pcr來評估染色質(zhì)結(jié)果，與參照基因比較結(jié)果。
研究人員證實，EpiQ染色質(zhì)分析試劑盒的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與多個細(xì)胞系中一些基因的表達(dá)水平密切相關(guān)。他們評估了四個不同細(xì)胞系(HeLa、PC3、LNCaP和HCT15)中四個組成型表達(dá)基因(GAPDH、ACTB、TBP和B2M)的近啟動子區(qū)域的染色質(zhì)狀態(tài)(下圖A)。每個基因的啟動子都處于開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。同時評估了同一細(xì)胞系中11個表觀遺傳學(xué)調(diào)控的基因啟動子(ABCB1、CDH1、CDH13、DAPK1、DKK1、GSTP1、PTGS2、TP73、WT1、p14ARF和p16INK4A)(下圖B)。染色質(zhì)狀態(tài)存在差異，并與基因表達(dá)水平密切相關(guān)。開放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū)域與中等到高水平的基因表達(dá)相關(guān)(右上角黑色框)，而封閉狀態(tài)與低水平相關(guān)(左下角)。EpiQ試劑盒輕松鑒定出PC3細(xì)胞中一個異常值基因(黑色箭頭)，它表現(xiàn)出一種表觀遺傳學(xué)調(diào)控的稀有形式—單等位基因甲基化，即只有一個等位基因被甲基化，導(dǎo)致50%的染色質(zhì)可接近和高水平基因表達(dá)。
確定HIV潛伏的機(jī)制
“我試圖確定病毒蛋白中的突變?nèi)绾斡绊懰c染色質(zhì)重塑因子之間的相互作用。EpiQ試劑盒讓我能夠評估病毒周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，以及病毒蛋白是否影響它?！奔又荽髮W(xué)伯克利分校的研究生Siddharth Dey說。
他在近的實驗中研究了一個病毒蛋白，它表現(xiàn)出重要的翻譯后修飾，并與多個細(xì)胞蛋白相互作用。此蛋白中的一些保守位點已鑒定出，對蛋白功能很關(guān)鍵，如果它們突變，病毒會變得不起作用。Dey想要研究共同進(jìn)化的位點，即某些位點的氨基酸與其他位點的氨基酸相關(guān)聯(lián)。
他的工作需要用序列比對的統(tǒng)計學(xué)方法來鑒定那些共同進(jìn)化的位點。一旦鑒定出，他就能通過實驗來檢驗這些位點。之后再研究它們在結(jié)構(gòu)或功能上如何重要。
EpiQ試劑盒在這些功能實驗中起了重要作用。研究表明病毒蛋白與多個細(xì)胞蛋白相互作用，包括SWI/SNF，一個染色質(zhì)重塑復(fù)合物。
過去，Dey使用**沉淀來解決這些問題。就目前這項研究以及今后的研究而言，EpiQ試劑盒不能取代**沉淀技術(shù)，而是作為補(bǔ)充。它給出信息，說明在哪些條件下需要用染色質(zhì)**沉淀來進(jìn)一步分析。
Dey希望終能夠完全了解HIV潛伏背后的分子機(jī)制，開發(fā)出抗病毒**對付HIV病毒。
與癌細(xì)胞增殖聯(lián)系起來
“這個試劑盒的主要應(yīng)用不太在于發(fā)現(xiàn)什么，而是為了解基因是否表達(dá)提供了一個捷徑。一旦你了解了這個，你就能設(shè)計實驗，來更詳細(xì)地了解為什么是這樣，”意大利Insubria大學(xué)結(jié)構(gòu)與功能生物學(xué)系Ian Marc Bonapace教授說。
Ian Marc Bonapace教授與一群日本科學(xué)家合作，在上世紀(jì)90年代末發(fā)現(xiàn)了UHRF1蛋白。UHRF1被發(fā)現(xiàn)以后，研究表明它在基因調(diào)控中扮演著重要的角色，它控制著細(xì)胞增殖時重建正確的DNA和染色質(zhì)修飾的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
Bonapace研究的主要目標(biāo)是確定UHRF1終以何種方式影響了癌癥**。他們認(rèn)為，此蛋白至少能作為癌癥侵襲性的一個標(biāo)志物。未來，他們希望能發(fā)現(xiàn)一些阻礙UHRF1活性的分子，這有可能作為一種阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的方法。
在這項研究中，他們使用的主要方法包括染色質(zhì)**沉淀、蛋白抽提和純化，共沉淀和凝膠過濾，以鑒定此蛋白參與形成了哪些復(fù)合物。在2010年初，Bonapace得到了EpiQ試劑盒。為了檢驗它的效果和適用性，他開展了一個實驗，在兩個不同的前列腺癌細(xì)胞系中比較三個不同的腫瘤抑制基因。這兩個細(xì)胞系分別為：非侵襲性的LNCAP和侵襲性的PC3。
Bonapace談到：“這些實驗的結(jié)果正是我們所預(yù)計的。LNCAP細(xì)胞中腫瘤抑制基因未下調(diào)，而PC3細(xì)胞中則完全下調(diào)(因此染色質(zhì)處于關(guān)閉狀態(tài))?！?/p>
Bonapace還談到，在得到EpiQ試劑盒之前，使用染色質(zhì)**沉淀方法來確定基因是否表達(dá)，一般需要幾天。而使用這個試劑盒，你能立即確定基因是否被抑制，之后再決定是否要通過耗時耗力的實驗來研究為什么。Bonapace還介紹了EpiQ試劑盒對其研究的潛在影響，不但大大節(jié)省時間，還能有效利用資源，因為他不斷檢測不同類型的細(xì)胞和腫瘤，看看同一個目的基因是否受UHRF1蛋白存在或缺失的控制。
