PCR Master Mix的成分及使用簡(jiǎn)介

進(jìn)行PCR試驗(yàn)時(shí)，往往要向PCR管中加入buffer、dNTP、DNA酶、引物、模板、水等各種pcr反應(yīng)所需的試劑，而在加入這些試劑時(shí)如果操作不規(guī)范很容易造成污染，導(dǎo)致PCR結(jié)果不準(zhǔn)確，因此，為了簡(jiǎn)化反復(fù)添加各種試劑便將buffer、dNTP、DNA Polymerase等試劑先混合到一起，即配制成Master Mix然后再使用，即簡(jiǎn)化了PCR操作步驟，也減少了污染的途經(jīng)。

一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

2×PCR Master Mix中含有2×Taq DNA Polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP，只需加入適量引物、模板和水即可進(jìn)行pcr擴(kuò)增。大大簡(jiǎn)化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導(dǎo)致的污染，使PCR的重復(fù)性更好。

利用2×PCR Master Mix可以進(jìn)行各種常規(guī)的PCR擴(kuò)增，特別適合用于定量和半定量的PCR擴(kuò)增，以及2kb以下DNA片斷的t載體克隆。

2×PCR Master Mix可以擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)8kb的片斷，但通常更適合用于擴(kuò)增2kb以下的DNA片斷。

本試劑盒用于50微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于160個(gè)反應(yīng)，用于20微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于400個(gè)反應(yīng)。

包裝清單：

二、保存條件：

-20℃保存。

三、注意事項(xiàng)：

由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴(kuò)增目的基因序列超過1000萬倍，在使用Taq酶時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。

Taq DNA polymerase在PCR過程中每循環(huán)的出錯(cuò)幾率約為2.2x10-5，對(duì)于大于1kb的DNA片斷的克隆推薦使用出錯(cuò)幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。對(duì)于普通的PCR或RT-PCR定性檢測(cè)或定量檢測(cè)，Taq DNA polymerase是佳選擇。

為了您的**和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

四、使用說明：

1. PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：

a. 溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將2XPCR Master Mix置于冰浴上或冰盒內(nèi)。

b. 參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)：

對(duì)于不同類型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：

哺乳動(dòng)物基因組DNA：0.1-1μg;大腸桿菌基因組DNA：10-100ng;質(zhì)粒DNA：0.1-10ng。

過多的模板DNA容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。

c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。

d. 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油

(mineral oil，ST275)。

e. 各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。

2. PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：

STEP1(起始變性): 94℃ 3min

STEP2(變性): 94℃ 30sec

STEP3(退火): 55℃ 30sec

STEP4(延伸): 72℃ 1min

STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles

STEP6(終延伸): 72℃ 10min

STEP6(臨時(shí)保存): 4℃ forever

a. PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件

包括溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。

b. STEP4(延伸)的時(shí)間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時(shí)間為1分鐘。例如

PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為2kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置

為2分鐘，以此類推。

c. 對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對(duì)于需進(jìn)

行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達(dá)到平臺(tái)期。

五、常見問題：

1. PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。

a. 引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中常見的問題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的

GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物

中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特

異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以

考慮更換引物。

b. 待擴(kuò)增片斷GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對(duì)比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高

GC含量DNA片斷的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)

的設(shè)置。

c. 長(zhǎng)片斷擴(kuò)增。盡管Taq DNA polymerase可以擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)8kb的DNA片斷，但大多數(shù)時(shí)候比較適合擴(kuò)

增3kb以下的片斷，更長(zhǎng)片斷的擴(kuò)增推薦使用其它更適合長(zhǎng)片斷擴(kuò)增的DNA聚合酶。

d. PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。

e. 由于引物存在一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)

可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55或50℃的方法，使退火

更加充分。

f. 退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的佳

溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索佳的退火溫度。

g. 延伸時(shí)間不足。可按照每1kb片斷延伸1分鐘進(jìn)行設(shè)置，對(duì)于較難擴(kuò)增的片斷可以設(shè)置為每1kb片斷

延伸1.5-2分鐘。

h. 待擴(kuò)增片斷GC含量較高或長(zhǎng)度較長(zhǎng)，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃

2-4min。

i. 在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。

j. 循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。

k. 模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)

計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，然后對(duì)**次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這

樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從**次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比

較簡(jiǎn)單地用原有引物對(duì)**次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不

能去除非特異性條帶。

l. 模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。

m. 當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。

n. 注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)有很大幫助。

PCR Master Mix現(xiàn)今已經(jīng)廣泛應(yīng)用在各種PCR實(shí)驗(yàn)中，如Real Time PCR、多重PCR、巢式PCR等。使用PCR Master Mix即可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，又可以避免因多次對(duì)PCR管進(jìn)行操作所造成的污染問題。