1989年，F(xiàn)ields**報(bào)告酵母雙雜交(Y2H)分析，這種方法利用轉(zhuǎn)錄因子與成對(duì)的蛋白質(zhì)兩部分相結(jié)合來(lái)檢測(cè)這些成對(duì)蛋白之間的相互作用關(guān)系。假如這兩種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，轉(zhuǎn)錄因子就可重建，從而激活報(bào)告基因，促使酵母生長(zhǎng)。
目前法國(guó)的Hybrigenics公司和瑞士的Dualsystems Biotech公司均提供Y2H篩選服務(wù)。
“酵母雙雜交有著巨大的優(yōu)勢(shì)，但也有一個(gè)不利之處：它可以檢測(cè)低親和力，”德國(guó)Max Delbrück分子醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)蛋白組學(xué)研究人員Erich Wanker說(shuō)。換句話說(shuō)，這種分析可以鑒別出微弱的短暫的配對(duì)蛋白例如那些延伸細(xì)胞信號(hào)的蛋白，但也可以檢測(cè)隨機(jī)撞在一起的蛋白質(zhì)?！暗降孜覀円嬲嘈旁谀膫€(gè)點(diǎn)發(fā)生了相互作用?”Wanker問(wèn)道。
現(xiàn)在科學(xué)家們已經(jīng)找到多種檢測(cè)和避免各種假陽(yáng)性結(jié)果的方法?！罢承浴钡鞍追翘禺愋越Y(jié)合到其他蛋白質(zhì)上的假象可以被鑒別和排除。通過(guò)單個(gè)導(dǎo)入蛋白而非重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)的酵母生長(zhǎng)，現(xiàn)在也可以被識(shí)別。
**的系統(tǒng)確保了所有期望的組合均能得到測(cè)試。現(xiàn)在不再采用所有的基因轉(zhuǎn)染相同的酵母細(xì)胞的方法篩查兩種潛在的互作伴侶，而是將轉(zhuǎn)染單個(gè)基因的酵母雜交，檢測(cè)其后代的生長(zhǎng)。機(jī)器人系統(tǒng)將酵母精細(xì)混合，每次分析可運(yùn)行多個(gè)重復(fù)。觀察到相同互作的次數(shù)成為了質(zhì)量評(píng)估的一部分?！拔覀冋J(rèn)為Y2H可以生成可靠且可重復(fù)的結(jié)果，”Wanker說(shuō)。
盡管如此，也還是有一些互作不會(huì)在Y2H中觀察到。例如，Y2H要求互作蛋白必須要使轉(zhuǎn)錄因子的兩部分重新結(jié)合，蛋白質(zhì)必須要能夠進(jìn)入細(xì)胞核激活報(bào)告基因。因此，膜特異性蛋白或細(xì)胞器特異性蛋白的互作就無(wú)法看到。
除了Y2H，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中低通量的檢測(cè)也可用于篩查相互作用：這些測(cè)試包括LUMIER(luminescence-based mammalian interactome)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用陷阱(mammalian protein-protein interaction trap,MAPPIT)系統(tǒng)、蛋白芯片和蛋白片段互補(bǔ)測(cè)定法(protein fragment complementation assay：PCA)。盡管它們的數(shù)量級(jí)低于Y2H，它們也可以探測(cè)更多相關(guān)背景下的互作。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用陷阱(mammalian protein-protein interaction trap,MAPPIT)系統(tǒng)是高通量的哺乳動(dòng)物篩選系統(tǒng)之一。該系統(tǒng)利用的并非是酵母轉(zhuǎn)錄因子，而是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子受體。這種細(xì)胞因子受體同樣被分割，當(dāng)重建時(shí)才能夠傳導(dǎo)信號(hào)。2009年，比利時(shí)法蘭德斯跨學(xué)院生物技術(shù)研究所(VIB)的網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)家Jan Tavernier描述了更高通量的MAPPIT系統(tǒng)，在這一系統(tǒng)中可編碼與細(xì)胞因子受體片段連接的潛在互作伴侶蛋白的質(zhì)粒被分別置于小孔中保存。實(shí)驗(yàn)之初，將可表達(dá)可與選擇性“誘餌”連接的細(xì)胞因子受體片段的細(xì)胞加入到小孔中。當(dāng)互作發(fā)生時(shí)，信號(hào)就會(huì)激活發(fā)光熒光素酶。
利用多孔板，花費(fèi)約2,000(2600美金)就可以篩選一個(gè)針對(duì)人類ORFeome(一整套克隆蛋白編碼開放閱讀框)的誘餌蛋白。 Tavernier表示希望能夠在今年晚些時(shí)候?qū)崿F(xiàn)在微芯片上運(yùn)行MAPPIT。微型化檢測(cè)可將成本降低到100，并在1星期內(nèi)檢測(cè)針對(duì)100個(gè)誘餌的 ORFeome。
Tavernier說(shuō)以這樣的高通量和成本，各種新實(shí)驗(yàn)將變得可行，而不再將篩查局限于酵母細(xì)胞。“你開始在適當(dāng)?shù)奈锓N中繪制完整的互作組，”Tavernier說(shuō)。此外，Tavernier還計(jì)劃用**或有毒化合物來(lái)處理的細(xì)胞比較互作組的變化。他希望能將這一技術(shù)商業(yè)化，并正與 Vidal及其他科學(xué)家們一起致力利用MAPPIT 和 Y2H檢測(cè)繪制人類蛋白質(zhì)互作。
LUMIER也是相對(duì)高通量的系統(tǒng)，可用于檢測(cè)是否存在受**、**或其他添加物影響的特異互作。在這些檢測(cè)中，兩種蛋白被用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。一種蛋白連接上稱之為FLAG的親水性肽。潛在的互作伴侶蛋白連接上熒光素酶。細(xì)胞裂解，F(xiàn)LAG標(biāo)記的蛋白被捕獲，利用它們發(fā)出的熒光來(lái)檢測(cè)互作伴侶蛋白的存在。
蛋白片段互補(bǔ)測(cè)定(PCA)既可以在酵母細(xì)胞也可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行，主要取決于重構(gòu)的大量“報(bào)告子”，通常是酶或熒光蛋白。因?yàn)閳?bào)告子能夠在整個(gè)細(xì)胞發(fā)送信號(hào)，在它們自然發(fā)生的地方就可以檢測(cè)到互作。
在2009年發(fā)布的論文中，Vidal, Wanker和其他研究人員描述了Vidal在高通量篩選中評(píng)估發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)互作的實(shí)證框架。事實(shí)上，這意味著重復(fù)實(shí)驗(yàn)采用了不同類型的檢測(cè)，并與對(duì)照組結(jié)果進(jìn)行了比較。陽(yáng)性對(duì)照是從文獻(xiàn)中仔細(xì)挑選出的大約100種已確立的互作。陰性對(duì)照是100個(gè)隨機(jī)指定的配對(duì)蛋白，它們過(guò)去從未發(fā)現(xiàn)能相互結(jié)合。對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行調(diào)整以提高對(duì)陽(yáng)性對(duì)照的檢測(cè)，而避**測(cè)隨機(jī)互作。
作為《自然方法》(Nature Methods)雜志上提出的框架的一部分，來(lái)自互作研究的結(jié)果應(yīng)該在不同類型的檢測(cè)中進(jìn)行確證。越多的方法發(fā)現(xiàn)相同的互作，研究人員就越能確信得到的結(jié)果。不過(guò)總體上，這些方法也只能檢測(cè)大約70%的陽(yáng)性參考設(shè)置。
高通量實(shí)驗(yàn)并不是**鑒別蛋白質(zhì)間互作的途徑。還有幾種數(shù)據(jù)庫(kù)，例如生物學(xué)相互作用通用庫(kù)(Biological General Repository for Interaction Datasets, BioGRID)和IntAct都搜集了文獻(xiàn)上發(fā)布的，從小型和高通量實(shí)驗(yàn)，以及其他分析推斷的預(yù)測(cè)互作中挑選出的互作列表。
歐洲生物信息研究所EBI(European Bioinformatics Institute)蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)協(xié)調(diào)員Sandra Orchard幫助開發(fā)了小的信息標(biāo)準(zhǔn)輔助分享和評(píng)估互作數(shù)據(jù)。她認(rèn)為這一列表甚至遠(yuǎn)未接近完成，她估計(jì)對(duì)于人類互作組，這個(gè)數(shù)字會(huì)小于百分之十，其中甚至包括已發(fā)表但還未被數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的數(shù)據(jù)。她說(shuō)?！叭绻苡^察到十分之三的酵母互作組，我們就是非常幸運(yùn)了?！?/p>
原文摘要：
Proteomics: The interaction map
As increasing numbers of protein–protein interactions are identified, researchers are finding ways to interrogate these data and understand the interactions in a relevant context.
Around the time that scientists celebrated the completion of the draft sequence of the human genome, papers from two separate groups described results of another project that tested all the possible pairings of thousands of yeast proteins to see whether they interact.
The importance of protein–protein interactions is beyond dispute. Little happens in a cell without one protein 'touching' another. Whether a cell divides, secretes a hormone or triggers its own death, protein–protein interactions make the event happen. Consequently, comprehensive maps showing which proteins came together in a yeast cell were much anticipated.
