如何選擇高內(nèi)涵分析儀器

高內(nèi)涵分析(High Content Analysis，簡稱HCA)是對高分辨率顯微鏡所拍攝細(xì)胞圖像的自動提取和分析。市場上有三個類型的這種儀器：寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵、共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵和激光掃描型高內(nèi)涵。研究人員應(yīng)當(dāng)如何選擇呢?本文就給出大家一些建議以供參考。

高內(nèi)涵分析是對高分辨率顯微鏡所拍攝細(xì)胞圖像的自動提取和分析。高內(nèi)涵，意味著豐富的信息。這些信息包括：單個細(xì)胞圖像和各項指標(biāo)，細(xì)胞群體的統(tǒng)計分析結(jié)果，細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的改變，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，熒光信號隨時間的變化，熒光信號空間分布的改變等等。人們往往因為特定的問題去設(shè)計實驗，在圖像中找到答案的同時，其他的信息會帶來意外的新發(fā)現(xiàn)。

論文中單幅熒光顯微圖像通常顯示的是陽性目標(biāo)的有或無，強(qiáng)或弱，是定性分析。而高內(nèi)涵技術(shù)的研究對象不是一個或少數(shù)細(xì)胞，而是對大量細(xì)胞的同時觀察和分析，從大量圖像中得到細(xì)胞群體的定量統(tǒng)計結(jié)果，結(jié)論更有科學(xué)說服力。因為分析的對象是完整的細(xì)胞，在一個實驗中可以同時使用多種熒光探針，大量細(xì)胞的多參數(shù)同時分析有助于更深入地理解復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)機(jī)理和相互作用。

此外，高內(nèi)涵技術(shù)還有助于人為偏差的消除。人們往往會選擇比較好的細(xì)胞來拍攝和分析，而機(jī)器是客觀的，所有樣品的成像分析條件是完全相同的。高內(nèi)涵分析可在培養(yǎng)細(xì)胞、組織切片甚至3D培養(yǎng)上開展。它有著廣泛的應(yīng)用，如**篩選、多參數(shù)功能研究、化學(xué)基因組學(xué)、靶標(biāo)驗證和毒性檢測等。

高內(nèi)涵技術(shù)實現(xiàn)了高速顯微成像，以前耗時費力的工作瞬間完成，研究人員可綜合海量信息更快做出決策。在**靶標(biāo)的確認(rèn)、化合物的藥理和毒性篩選上，高內(nèi)涵分析優(yōu)勢明顯，而對于復(fù)雜細(xì)胞學(xué)機(jī)理的研究，HCA所提供的有價值的信息可以幫助研究人員在日益激烈的科研競賽中勝出。

經(jīng)過這些年的發(fā)展，市場上出現(xiàn)了很多高內(nèi)涵儀器(如下表)，這些儀器可以分為三大類：寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵、共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵和激光掃描型高內(nèi)涵。

表1. 各種類型的高內(nèi)涵儀器舉例

激光掃描型高內(nèi)涵是以激光作為熒光光源，用PMT采集光信號，通過預(yù)設(shè)間距點掃描獲得數(shù)據(jù)，沒有成像的過程，速度快是其大的優(yōu)勢。但這類儀器的局限性是分辨率不高，只能提供虛擬圖像。X軸的分辨率是以預(yù)設(shè)的間隔(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或5 um)設(shè)定的，而Y軸是用戶自行設(shè)定的，一般在1到10 um。由于不是基于圖像的分析，分析軟件相對簡單，適合于比較成熟簡單的細(xì)胞學(xué)實驗。所以被很多**研發(fā)企業(yè)作為初篩平臺。

而基礎(chǔ)研究的實驗設(shè)計相對復(fù)雜，很多時候需要在亞細(xì)胞水平對細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)清晰成像，檢測的指標(biāo)也復(fù)雜多樣，需要非常強(qiáng)大的圖像分析軟件來設(shè)定，所以顯微鏡型的高內(nèi)涵更適合科學(xué)研究的需要，**研發(fā)機(jī)構(gòu)在復(fù)雜的篩選實驗也會考慮使用顯微鏡型高內(nèi)涵儀器。

在選擇高內(nèi)涵儀器時主要考慮三個方面：成像速度、成像質(zhì)量和圖像分析軟件功能是否強(qiáng)大。

1.成像速度

高內(nèi)涵儀器是在顯微鏡的基礎(chǔ)上搭建的高速顯微成像的平臺，從所得圖像中抽出一張和普通顯微鏡拍攝的圖像沒有區(qū)別，也就是說，寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵提供的是寬場熒光顯微圖像，而共聚焦熒光顯微鏡型高內(nèi)涵提供的是共聚焦質(zhì)量的圖像。

高內(nèi)涵儀器和普通顯微鏡本質(zhì)的區(qū)別在于成像速度極大提高。如果每個孔取一個視野，雙色熒光，Hoechst染細(xì)胞核，EGFP標(biāo)記細(xì)胞器，硬件自動聚焦，GE Healthcare的IN Cell 2000可以在約3分鐘內(nèi)對整塊96孔板成像，在短短幾分鐘內(nèi)得到將近200張照片。IN Cell 2000能夠高速成像是因為：1)明亮的光源，和顯微鏡以液體光導(dǎo)纖維相連，光的傳輸效率高，顯著縮短曝光時間;2)大芯片CCD相機(jī)可選擇，成像視野約是標(biāo)準(zhǔn)芯片相機(jī)成像視野的四倍，大芯片CCD相機(jī)一個視野就有可能捕捉到足夠的細(xì)胞用于統(tǒng)計學(xué)分析，節(jié)省很多時間;3)在線細(xì)胞計數(shù)功能：微孔板各個孔中細(xì)胞的生長狀態(tài)可能會不同，在線細(xì)胞計數(shù)針對不同的孔自動調(diào)整拍攝視野數(shù)量，整體縮短實驗時間;4)自動聚焦：是提高成像速度的關(guān)鍵，IN Cell 2000提供基于激光的硬件自動聚焦和基于圖像對比度的軟件自動聚焦，二者可結(jié)合使用。

雖然寬場熒光顯微鏡型高內(nèi)涵比普通寬場熒光顯微鏡成像速度快，共聚焦型高內(nèi)涵比共聚焦顯微鏡成像速度快，但共聚焦型高內(nèi)涵未必比普通寬場熒光顯微鏡成像速度快，所以用戶須根據(jù)實驗的需要來選擇適合自己的高內(nèi)涵儀器。IN Cell 2000雖然不是共聚焦高內(nèi)涵，但其獨有的去卷積圖像復(fù)原功能可以顯著提高圖像的對比度和分辨率，提供可與共聚焦圖像媲美的高質(zhì)量的圖像。

2、圖像質(zhì)量和成像速度之間的平衡

科研用戶既希望成像速度快，又希望圖像質(zhì)量好，可以考慮GE Healthcare的IN Cell 6000。它是以激光為光源的可變光闌線掃描共聚焦高內(nèi)涵儀器，擁有**的光學(xué)系統(tǒng)，成像完全可調(diào)：光闌完全打開時成像速度快，完全共聚焦模式去除背景有效，光闌打開的程度在1-3 AU之間可調(diào)，可以針對不同的需求調(diào)節(jié)共聚焦程度，達(dá)到成像速度和圖像質(zhì)量的優(yōu)化組合。IN Cell 6000感光成像采用550萬像素新一代sCMOS相機(jī)，噪音比CCD相機(jī)低五倍，超高靈敏度并縮短曝光時間，比標(biāo)準(zhǔn)相機(jī)的視野大四倍。

3、圖像分析軟件

科研用戶檢測的指標(biāo)復(fù)雜多樣，除了基本的模塊式分析工具，還需要有更強(qiáng)大的分析軟件允許用戶自主定義分析程序。GE Healthcare的高內(nèi)涵平臺除了基本的分析工具，還提供IN Cell Developer Toolbox 客戶自定義分析軟件，可以分析各種實驗的圖像結(jié)果。針對特定的實驗，用戶使用一系列的圖像分析工具來編寫自己的分析程序，包括：**區(qū)分(segmentation)工具，圖像處理工具，自定義測量值，宏子程序等。Developer Toolbox曾獲得2006年全球佳生物圖像分析軟件獎(美國知名科學(xué)雜志《Scientific Computing》頒發(fā))。

Spotfire是一款用于科學(xué)數(shù)據(jù)分析的可視化分析平臺，其大的特點是通過多種動態(tài)的圖形(點圖、線圖、柱狀圖、餅狀圖、熱圖等)和篩選條件，快速對大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，并可以做出報告或與他人分享結(jié)果，做出決策。支持多種客戶端界面和Web界面的訪問和顯示。IN Cell 圖像分析軟件內(nèi)嵌和Spotfire DecisionSite Basic軟件連接的圖標(biāo)，輕松使用數(shù)據(jù)可視化分析工具。

IN Cell Miner HCM數(shù)據(jù)管理軟件以經(jīng)過驗證的 EMC Documentum 軟件為基礎(chǔ)，可以方便地注釋、建檔、檢索、存儲高內(nèi)涵圖像和數(shù)據(jù)。研究機(jī)構(gòu)的所有使用者可以分享和比較數(shù)據(jù)，大限度地挖掘和實現(xiàn)這些數(shù)據(jù)的價值?？焖僦谱鼍赖臄?shù)據(jù)圖，用于工作展示、技術(shù)交流和文章發(fā)表。